Entwicklung von MEKC- und HPLC-Methoden zur Bestimmung von Fettsäuren, Fettsäurehydroperoxiden und Hydroxyfettsäuren

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In dieser Arbeit wurden MEKC- und HPLC-Methoden zur Bestimmung von ungesättigten Fettsäuren und den davon abgeleiteten Hydroxy- und Hydroperoxyfettsäuren entwickelt. Die Quantifizierung dieser Verbindungen erfolgte durch den Einsatz von UV/VIS- und UV/VIS-Diodenarray-Detektoren nach enzymatischer und chemischer Hydrolyse von Phospholipiden und Triglyceriden aus biologischem Probenmaterial. Zur Erhöhung der Nachweisempfindlichkeit und der Selektivität wurden Nachsäulenderivatisierungsreaktionen in Verbindung mit Fluoreszenz- bzw. Chemilumineszenzdetektion eingesetzt.

Ein Schwerpunkt lag in der Optimierung der chromatographischen und elektrophoretischen Trennung. Die MEKC ermöglichte sowohl unter reversed-flow- als auch unter normal-flow-Bedingungen eine Auftrennung der isomeren Hydroxy- und Hydroperoxyderivate der Öl-, Linol-, Linolen- und Arachidonsäure. Das normal-flow System hatte aber deutliche Vorteile hinsichtlich der Analysenzeiten und der theoretischen Bodenzahlen (ca. 106 m-1). Für die MEKC-Methoden wurden Nachweisgrenzen von 4 bis 100 µM routinemäßig erreicht. Um die Nachweisempfindlichkeit der UV/VIS-Detektion zu steigern, wurden "Bubble-Cells" eingesetzt, welche den Response für alle Analyten um den Faktor 5-7 erhöhten. Zur Anwendung der LIF-Detektion wurde auf eine früher entwickelte Nachsäulenderivatisierungstechnik zurückgegriffen, bei der die Hydroperoxyfettsäuren und p-Hydroxyphenylessigsäure (PES) in Anwesenheit von Mikroperoxidase-11 (MP-11) selektiv ein Produkt erzeugen, dessen Fluoreszenz (λ ex = 325 nm, λ em = 415 nm) gemessen wird. Das zur Derivatisierung benötigte MP-11 war an der Wand einer Reaktionskapillare immobilisiert, die totvolumenfrei mit einer Trennkapillare (fused-silica) gekoppelt wurde. Eine Computersimulation der Vorgänge in der Reaktionskapillare ergab, daß ein Verlust der Trennung nur dann vermieden werden kann, wenn entweder der Umsatz sehr schnell ist oder das gebildete fluoreszierende Produkt eine ähnliche Mobilität wie die Hydroperoxide besitzt. In Versuchen wurde gezeigt, daß unter optimalen reversed-flow-Bedingungen das Produkt von PES tatsächlich mit den Hydroperoxiden migriert und PES für die Nachsäulenreaktion das beste Reagenz unter mehreren käuflichen Analoga darstellt.

Zur Bestimmung der aus Triglyceriden und Phospholipiden freigesetzten Fettsäuren und Hydroxy- und Hydroperoxyfettsäuren wurden auch RP-HPLC-Methoden mit UV-Detektion bei 195 und 234 nm eingesetzt. Durch die Verwendung einer Fluoralkylphase (Fluofix) gelang die Antrennung einzelner Isomere der oxidierten Fettsäuren. Mit der fast HPLC ließen sich die Analysenzeiten auf unter vier Minuten reduzieren. Die Linearität der Methoden erstreckte sich über mehrere Größenordnungen von der Nachweisgrenze (0.2 bis 0.9) bis zu einer Konzentration von 1500 µM. Für den sicheren Nachweis der Hydroperoxyfettsäuren in komplexen Matrices wurden Empfindlichkeit und Selektivität durch den Einsatz von Nachsäulenderivatisierungsreaktionen weiter verbessert.

Die erarbeiteten Methoden wurden zur Bestimmung der in biologischem Probenmaterial vorliegenden nichtoxidierten und oxidierten Lipide eingesetzt. Neben Ölen, Soja- und Eilecithin wurden auch Proben mit komplexerer Matrix wie Blutserum, Synovia und LDL (Low-Density-Lipoprotein) untersucht. Bei der Hydrolyse der Phosphatidylcholine stellte sich heraus, daß die Lipasen einen Teil der Hydroperoxide abbauen, was besonders bei geringen Hydroperoxidkonzentrationen die Wiederfindung stark herabsetzt; für solche Proben war die alkalische Hydrolyse mit Natronlauge geeigneter als die enzymatische. Die MEKC hatte gegenüber der HPLC den Vorteil, störende Matrixbestandteile von den Analyten abzutrennen. Aus diesem Grund gelang die MEKC-Bestimmung isomerer Hydroxyfettsäuren der Linol- und Arachidonsäure in natürlichem LDL bei 234 nm durch UV-Detektion. Die Konzentrationen der Hydroxyfettsäuren wurden zu ca. 18 µg HODE und 30 µg HETE pro Gramm LDL bestimmt und waren damit etwa 600mal so hoch wie die der Hydroperoxide. Da die Hydroxyfettsäuren in biologischer Matrix offenbar nur langsam abgebaut werden, sind sie bessere Marker für die Lipidperoxidation als die Hydroperoxide.

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Dokumententyp:
Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Fakultäten und Einrichtungen:
Fakultät für Mathematik und Naturwissenschaften » Chemie » Dissertationen
Dewey Dezimal-Klassifikation:
500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie » 540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
Sprache:
Deutsch
Kollektion / Status:
Dissertationen / Dokument veröffentlicht
Dokument erstellt am:
18.04.2001
Dateien geändert am:
22.01.2018
Datum der Promotion:
30.03.2001
Medientyp:
Text